自动血细胞分析仪的检测技术及使用-武汉盛世达医疗设备有限公司

一 血细胞分析仪的发展

50年代以前，用来代替手工镜检的血细胞计数器，采用的是电容法或者光电能量转换法。这类计数器容易受到外界环境的干扰，测量的敏感性和精确性都很差。到了50年代，Coulter发明了电阻抗测量技术，得到较好的测量结果，该技术一直被各种血细胞分析仪所沿用。用电阻抗法和光电比色法相结合，可以进行血细胞的基本分类和血红蛋白的测定，能满足血常规检查的要求。60年代发达国家的临床血液检验室，都配备了各种形式的血细胞计数仪。

电阻抗法是通过测量细胞的大小进行血细胞的分类计数，因此只能对白细胞进行“三分类”，即分成淋巴细胞，中间细胞(主要为单核细胞，也有一些嗜酸，嗜碱，原始和幼稚细胞及异型细胞)和粒细胞(主要是中性粒细胞)。显然这种简单的分类方法，只适用于血常规检查和作规模较大的过筛检查，要进行更细致的分类有赖于新的检测技术。从80年代中期开始，对白细胞的分类从“三分类”发展到“五分类”，即可以分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和中性粒细胞。进入90年代，高档的分析仪还可以检测出幼稚细胞和T淋巴细胞，能对细胞进行免疫分型，能进行网织红细胞计数。目前可进行“五分类”的高档分析仪的检测技术有四种，即电阻抗、高频电导和激光散射联合检测法; 电阻抗和射频电导联合检测法; 激光散射和细胞化学染色联合检测法，以及多角度激光偏振光散射检测法。

这些检测技术主要用在Coulter，Sysmex，Technicon和Abbott四家公司推出的高档分析仪上，这些先进的分析仪器能为临床提供多达四十余项的实验参数。

80年代中期，我国在北京、上海、南京、山东、辽宁等省市生产过基本分型的半自动血细胞计数仪，但质量不稳定，常出现堵孔及取样和计数不准的问题，因此国产仪器的市场比较小，大部分医院尤其是大中型医院使用的是进口机型。

90年代，北京生化分析仪器厂引进日本ERMA株式会社的配件组装成PC-603，PC-604等机型。南京半导体器件总厂第二设计所研制成XF-9030型分析仪。上海国嘉光电有限公司研制成JX-J300型激光型分析仪，采用激光散射法，有配套试剂。上述这些仪器中，有的质量较好，测量精度已达到国外80年代的阻抗法仪器的水平，推向市场后解决了一部分国内市场的需求，特别是基层医疗单位的需求。

二 血细胞分析仪的检测原理

1.“三分类”分析仪

这类分析仪采用的是Coulter原理，即小孔电阻抗法，测量的基础是细胞的体积不同，它们通过小孔时对恒流场产生的阻抗作用也不同，由此在小孔两边的电极上产生的电压脉冲信号的幅度也不一样。在计数红细胞时，利用一个脉冲幅度甄别器，将幅度较小的血小板脉冲去掉，保留红细胞和白细胞脉冲，因血液中白细胞的数量不足红细胞的1/500，故其总数可认为是红细胞计数(白细胞的体积比红细胞的体积略大，不容易区分)。在计数白细胞时，利用溶血剂使红细胞溶解，再对剩下的白细胞计数。在计数血小板时，将脉冲幅度甄别器的阈值调低，计出红细胞和白细胞及血小板的总数，再减去红细胞的计数(其中已包括了白细胞计数)，剩下的即为血小板计数。由于细胞通过小孔时，在测量有效区内可能同时聚集了数个细胞，而测得的只是一个幅度较大的脉冲。血液标本经稀释后不可能绝对均匀，细胞的流动也不可能绝对均匀，这种数个细胞同时出现在小孔附近的情况，有一定的发生几率，在计数完成后须对计数值进行补偿和校正。

由于溶血剂可使白细胞的胞浆发生绕核皱缩，仪器测量到的白细胞体积已不再是它们的原来体积，仪器得到的白细胞直方图所反映的只是白细胞的相对大小，皱缩后白细胞的体积与原有的细胞核所占体积的大小有关。根据Coulter分类法，白细胞体积在35~90 fL范围内的为淋巴细胞(淋巴细胞的真正体积在50~99 fL)，包括正常和异常淋巴细胞; 体积在90~160 fL范围内的为中间细胞，主要是单核细3胞(体积在100~ 160 fL)，还包括一些原始和早期的粒细胞及嗜酸和嗜碱性细胞; 体积在160~ 450 fL范围内的为中性粒细胞，还包括一些中晚期粒细胞及嗜酸和嗜碱性细胞。因此利用白细胞的直方图可以对三种类型，即淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞进行初步分类。从临床结果来看，仪器的白细胞分类以淋巴细胞和中性粒细胞的符合率较高，而中间细胞(主要是单核细胞)的符合率则较低，有的报道认为小于50％。

在被溶血剂溶解的血红蛋白中加入转化剂(一般用氰化钾)，使之形成颜色稳定的氰化血红蛋白，再利用光电比色法测得血红蛋白的含量。使用光电比色法要将光路封闭，防止散射光和外来光的影响。有的机型采用双波长(540 nm和690 nm)测量法，可以有效避免光源不稳定和杂散光所造成的误差，也能抑制散射光所造成的影响。

2.“五分类”分析仪

a. 电阻抗、高频电导和激光散射联合检测法

这是Coulter公司1987年推出的新技术，早期只用于白细胞的分类，到90年代初用于网织红细胞检测。近年推出的STKS和MAXM系列可同时完成全血细胞技术、白细胞分类、细胞免疫分型、T淋巴细胞检测和网织红细胞计数等多种测量。电阻抗法不能区分体积相同的细胞，使用高频电导法和激光散射法可以弥补这一缺陷。细胞壁对低频电流产生很高的阻抗，但能通过高频电流; 而细胞核的大小不同和细胞器不同，细胞内颗粒的大小和密度不同，它们对高频电流的阻抗也不同，因此可以用来区分白细胞。激光散射技术主要用来检测细胞膜的表面特征和内部结构。激光散射对细胞颗粒的构型和密度的区别能力强，粗颗粒产生的光散射比细颗粒强，可以借此将粒细胞区分开。

b. 电阻抗和射频电导联合检测法

Sysmex公司的SE-9000采用的就是这种方法，这类仪器分别采用四个检测系统来检测不同类型的细胞。

(1) 淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞检测系统: 在细胞悬浮液中加入溶血剂使红细胞溶解，而使白细胞保持(近似于)原来的生理状态。对白细胞进行电阻抗法(测量细胞体积)和射频电导法(检测细胞核和颗粒密度)的联合检测，从而将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个群体。

(2) 嗜酸性细胞检测系统和嗜碱性细胞检测系统：在细胞悬浮液中加入特异的溶血剂(检测嗜酸性细胞的系统加入Stromatolyzer-EO，检测嗜碱性细胞的系统加入Stromatolyzer-BA)，使嗜酸性细胞或嗜碱性细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，再对保持完整的嗜酸性细胞或嗜碱性细胞进行计数。

(3) 幼稚细胞检测系统: 在细胞悬浮液中加入硫化氨基酸，由于占位不同，结合在幼稚细胞的氨基酸较成熟细胞多，当加入溶血剂时，成熟细胞被溶解，只保留着可能存在的幼稚细胞来计数。

c. 激光散射和细胞化学染色联合检测法

Technicon H系列分析仪采用的就是这种技术，它利用激光散射和过氧化物酶染色技术进行细胞分类。嗜酸性粒细胞有很强的过氧化氢酶活性，中性粒细胞胞浆内含有较为丰富的过氧化氢酶，单核细胞次之，原始细胞则极少，而淋巴细胞和嗜碱性细胞则缺乏此酶。用过氧化氢酶将血液染色的具体方法是:用含有清洗剂和甲醛的高渗液体，将微量血液按适当的倍数稀释，并培养几十秒钟(在40~70℃)。此时细胞被清洗剂破坏，甲醛使细胞浆内酶固定。此后进行第二步反应，加入过氧化氢和四氯—萘酚并加热十余秒，此时待测细胞中的过氧化氢酶分解过氧化氢产生O，后者使四氯—萘酚显色并沉淀定位于含酶的颗粒中。此类细胞经过激光束，由于光散射及细胞大小的不同而被区分开。而淋巴细胞和嗜碱性细胞不含过氧化氢酶，不能被检测到。因此仪器专门设置了嗜碱性细胞检测系统，它的测量通道采用时间差的方法，与红细胞/血小板的测量系统共用一个通道。由于试剂的作用，除嗜碱性细胞以外的所有细胞均被溶解，嗜碱性细胞和其它细胞裸核一起流入测量通道，通过对细胞前向角和散射角的测量产生细胞分布图，嗜碱性细胞由于呈高狭角散射，定位于图的上半部，裸核则位于图的下半部。不同的裸核因结构不同，分布也有所不同，单个核位于左方，分叶越多越靠右方。

d. 多角度激光偏振光散射检测法

Abbott公司的CD-3000，CD-3500，CD-4000采用了此技术。仪器先用鞘流液将标本血稀释，稀释后白细胞的内部结构近似于自然状态，只有嗜碱性细胞由于其吸湿的特性而使细胞结构有轻微改变。红细胞内的血红蛋白在高渗透压的作用下，从细胞内分离出来。而鞘液的水分则进入红细胞内，使细胞膜结构仍然完整。而它已与鞘液的折光系数相同，不影响白细胞的检测。仪器同时从四个角度测量通过激光束的细胞所产生的散射光，0°前角光散射用来测定细胞的体积，10°狭角光散射用来测定细胞结构及其复杂性的相对指征，90°垂直光散射对细胞内部颗粒及细胞质进行测量，90°消偏振光散射将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。

三 影响血细胞分析仪测量结果的因素

1． 试剂和标本温度

目前所有“三分类”仪器都采用Coulter电阻抗法，所用溶血剂可使白细胞膜穿孔，细胞失水皱缩。当仪器的管路和试剂的温度较低时，不仅白细胞的体积会发生变化，而且还会影响溶血剂与白细胞膜的正常作用，不能使白细胞产生有效的皱缩，从而导致白细胞分类出现异常。当标本温度较低时，可因冷球蛋白或冷纤维蛋白聚集，或者发生红细胞凝集，而影响到部分病人的白细胞分类和计数。此外，由于溶解度降低而导致病人血中的脂肪小滴或脂肪球等可溶性颗粒体积发生变化，也会影响到白细胞的分类和计数。根据多数人的研究结果，当室温保持在25℃左右时，对测量结果的影响已经很小，因此在有条件的地方应该给机房安装空调机，以保证仪器的管路和试剂的工作温度(新推出的一些仪器上已经设置了试剂恒温系统)。当标本的温度过低时，可以在测量前将标本在37℃的恒温箱中放置一定时间(一般20 min即可)。

2. 使用末梢血标本

根据检验学专家们的推荐，在使用血细胞分析仪时，应尽量采用静脉血抗凝标本，并在一定的时间内(30 min~4 h)稀释后即时测定。在全自动分析仪上使用静脉血抗凝标本，只需将全血标本送到仪器的取样探针处启动测量，仪器便自动完成“吸入→稀释→分流→检测→分析→显示和打印”的全过程，血细胞的数量和体积都不受预稀释的影响，使分析结果的准确性优于使用末梢血标本。

在实际工作中，大部分医院仍然在使用末梢血标本。使用末梢血标本的缺点在于：

(1) 采集的血量较少，一般情况下需要进行预稀释;

(2) 由于穿刺深度不够，采吸不畅，需要进行指端挤压，会将过多的组织液挤入血中，操作不当时还可将一些上皮细胞带入血中，穿刺和挤压也可能激活血液中的凝血因子，特别是外源性凝血只需10 s的时间，如果不能及时抗凝，则可能形成一些极细微的纤维蛋白丝状物，并可导致一些血小板的聚集，这些都将影响到仪器的检测结果。

3. 预稀释标本放置时间

使用末梢血标本时，大部分情况下是先准备好稀释液，去病房或门诊将采集的标本预稀释，最后再送回实验室进行集中测定。标本量越大，预稀释后放置的时间也会越长，而且在有的情况下，还可能因故不能将稀释好的标本即时测定。

一般认为，红细胞和白细胞的总计数及血红蛋白测定，受预稀释标本的放置时间的影响较小，但白细胞分类和血小板计数则受其影响较大。如果预稀释标本放置的时间较长，则白细胞在加入溶血剂之前即已发生皱缩，当加入溶血剂之后，不同类型的白细胞之间的大小差异就不太明显，尤其是中性粒细胞和中间细胞很难被区分，要进行白细胞的“三分类”，结果就变得不可靠。血小板是体积最小的血细胞，细胞膜薄而易碎，标本放置时间越长则破碎越多，当碎块很小时会导致血小板计数的减少，当碎块很大时会导致血小板计数的假性增高。因此，无论是静脉血抗凝标本还是末梢血标本，在预稀释后放置的时间都不应过长(一般不应超过20 min)，否则白细胞的分类和血小板的计数结果将不可靠。

4. 试剂

如果条件允许，应尽量使用仪器生产厂家提供或推荐的试剂。有的医院为了节省开支，自行配制试剂(大部分是稀释剂)，或者采用一些价格较便宜的国产试剂(如溶血剂)，则应该注意试剂对分析结果的决定性影响，下面以溶血剂为例予以说明。

溶血剂是血细胞分析仪中最主要的试剂，它的功能是在稀释液的作用下，使红细胞在极短的时间内完全溶解，而使白细胞保持颗粒状态(只作白细胞总计数的仪器)，以保证白细胞计数的可靠性。具有白细胞“三分类”计数的仪器，溶血剂还需要对白细胞产生修饰作用，能在一定时间内控制各类白细胞内容物的释放，维持其体积大小。溶血剂对各类白细胞的选择性作用，依靠合适的溶血剂浓度和溶血作用时间。如果溶血剂中表面活性物质的浓度过高，或者作用时间过长，超出了细胞所能承受的限度，中性粒细胞的膜会受损，体积会变小，甚至成为裸核。如果溶血剂中表面活性物质的浓度过低，或者溶血时间过短，部分淋巴细胞的体积会超过90 fL，部分中间细胞的体积会超过160 fL，甚至有少量红细胞没有溶解，使白细胞计数增高，及淋巴细胞的计数和比例增高。

四 应重视手工镜检复查

1. 意义

自动血细胞分析仪提高了细胞计数的精度和速度，而且具有数据管理功能，从而降低了手工辗转所造成的错误，其变化率由8~20％降低到2~4％，使计数结果的CV值由手工计数法的8~ 15％下降到1~3％。可见使用血细胞分析仪不但提高了工作效率，还大大提高了实验结果的精确度。并能提供最多可达四十余项的实验参数，从不同的侧面对反映到血细胞异常的疾病进行实验诊断。

然而，再先进的仪器也不能完全取代手工方法，仪器检测技术本身的缺陷， 各种非仪器因素对测量的干扰，病人的个体差异等因素常常导致仪器的测量结果发生误差。不但半自动分析仪的精确性较差，“三分类”和“五分类”的自动分析仪也有一定的误差，同样，目前最先进的高档分析仪，也仍然无法达到完全可靠的程度。据文献报道，自动分析仪与人工镜检的相关系数，有的仪器不到0.7，有的仪器系数较高的项目也不到0.97。血细胞分析仪是一种理想的过筛工具，但对于临床怀疑的病人标本的异常和正常，不能只看仪器的检测结果，应结合临床，同时考虑到仪器的检测原理和误差因素，对检测结果进行全面分析，必要时应及时作手工镜检复查。这一点必须引起检验工作者的足够重视。

2. 镜检复查

典型的白细胞直方图，体积应显示在35~450 fL的范围内。现在大部分的分析仪，还设计了小于35 fL的区域以监视异常“颗粒”。在分析仪的使用过程中，白细胞直方图上有小于35 fL的曲线的情况时常出现，其主要原因有两种。

a. 血小板的影响: 血小板的体积最大可达50~70 fL，大于20 fL的血小板可出现在直方图上35 fL以下曲线上。此外，血小板聚集后形成的大“颗粒”，也会出现在35 fL以下的曲线上。病人自身的疾病可引起血小板聚集，但采血过程和抗凝剂使用不当(现已探明，使用EDTA抗凝剂偶尔会使血小板出现聚集现象)，也会引起血小板聚集。血小板在35 fL以下的曲线上出现，会干扰细胞的计数，造成小红细胞或淋巴细胞的假象。

b. 红细胞的影响: 体积变小的红细胞，形态异常的红细胞及红细胞碎片，都会出现在白细胞直方图上35 fL以下区域的曲线上。随着新的从三维空间观察细胞的分析技术的出现，这种红细胞导致的假象可望被排除。

作为一个需要作手工镜检复查的例子，我们可以看到，当仪器的检测结果中，白细胞直方图上出现35 fL以下区域曲线，则需要作涂片镜检，这样有助于排除细胞计数中的干扰成分，作出正确的细胞分类。

五 自动血细胞分析仪的维护

1. 排除干扰

血细胞分析仪受到电源的干扰，或者其它射频源的干扰时，会出现血小板空白计数增高，这是电阻抗法分析仪的一个共同现象。可以采取以下措施加以排除。

(1) 仪器必须远离强的电磁场，否则这种空间射频电磁场的干扰，将严重影响血小板的计数。

(2) 仪器的外壳必须有良好的接地，如果仪器还配有稳压电源和打印机等设备，则应将它们也在同一点接地。

(3) 仪器最好能配上性能优良、功率裕量足够大的净化交流稳压电源。

如果仪器的电脑需要配接UPS电源，则应选择性能优良，稳压精度高，输出波形接近正弦波的在线式UPS电源。建议在UPS电源前，再配接一个抗干扰能力强的净化交流稳压电源，这样对抗干扰能力较差的分析仪，在受到干扰时可以有效避免电脑出现程序混乱或死机故障。

2. 预防和排除故障

血细胞分析仪的关键技术有三项。

(1) 检测器小孔的加工，小孔的孔径为100 mm，孔深为70 mm，使用宝石材料，对加工技术要求很高。国产仪器的主要问题是小孔的加工不过关。

(2) 脉冲计数和幅度分析器，这是电阻抗法分析仪的核心电路。

(3) 液路及其控制电路，这是保证吸样和稀释准确，并使待测液均匀流过小孔的关键。

血细胞分析仪发生最频繁的故障是堵孔，总的情况是半自动分析仪较全自动分析仪多，国产分析仪较进口分析仪多。堵孔的原因主要有两个方面。

(1) 仪器本身质量不过关，表现为小孔加工不良，液路设计不合理等。

(2) 操作者使用和保养不当。

比如，有的操作者在抽血时用棉球擦拭微量吸管，将一些棉花纤维带入标本，而改用长纤维卫生纸擦吸则好得多。另外，操作环境中的尘埃及其它异物，也会带入试剂或标本中，进而进入测试管路，因此，保持仪器操作环境的清洁很重要。

当分析仪发生堵孔后，一般用仪器的清洗程序即能排除，如果堵塞严重不能冲洗干净，则需要拆下测量室，按照仪器的操作要求，用厂方提供的工具和清洗液进行清洗。装复测量室时要将线接牢，如果接触不良有接触阻抗，将会产生较强的干扰，影响测量结果，甚至无法测量。

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